干细胞与纳米医学 ——纳米示踪剂、抗氧化纳米材料及磁性纳米材料与干细胞治疗
撰文│秦 瑶 成 昱
编辑│毕紫娟
审校│汤红明
作者简介
成昱 教授
现任同济大学医学院副院长，同济大学附属东方医院再生医学研究所研究员。聚焦铁基纳米材料的抗肿瘤治疗，建立自组装磁性材料作为磁力刀进行微磁力肿瘤物理治疗。自主研发微磁力调控设备，积极进行微磁力产业化和临床应用对接。承担国家自然科学基金面上项目，上海市教委科研创新计划重大项目及上海市科委国际合作等项目，2020年获国家优秀青年科学基金。近年来在Advanced Materials、AdvancedScience 、Small 、Angewandte Chemie International Edition 、Theranostics 、Journal of Controlled Release 等杂志发表系列论文，单篇他引次数超过500 次。
纳米医学是将纳米科学与技术的原理和方法应用于医学领域的一门学科。随着纳米技术快速发展，纳米医学与干细胞结合已成为研究热点。纳米材料因其特殊纳米尺度效应、丰富的材料种类、可调变的材料结构及可集成的多种性能，得到医学领域的广泛关注。往期的报道已经涉及纳米材料在干细胞组织工程支架、肝移植、肿瘤相关疾病治疗及医疗美容等领域中的应用，本期报道将围绕纳米探针在干细胞移植中的成像示踪、抗氧化、物理调控等方面的近期研究进展进行一个概括和总览。
1 探针在干细胞移植中的成像示踪
开发合适的干细胞活体示踪剂跟踪干细胞移植到体内后的存活、迁移以及增殖分化状况对了解干细胞的安全性和作用机制，促进干细胞治疗的临床转化非常重要。理想的干细胞活体示踪剂应该具备安全、长时间稳定标记、能指示干细胞的生存状态、能抗细胞增殖稀释、反映干细胞分化及功能发挥情况的特点。这些特点给现有医学影像技术及活体示踪剂的研发提出了巨大挑战。目前虽然没有一种示踪探针能满足干细胞示踪的所有要求，但纳米探针仍然以其相对简单的标记方式、高的信噪比、高稳定性及可诊疗一体化集成等特点，成为近些年干细胞影像探针的研究热点，用于标记并监测移植干细胞的位置、迁移、存活和分化。
1.1 光学成像纳米示踪剂
荧光成像属于经典的光学成像技术，具有高灵敏度、特异性、低成本等特点。对在体示踪来说，基于传统小分子荧光染料或者荧光蛋白的成像存在严重的生物荧光背景干扰、容易光漂白且只能用于浅表成像等问题，限制了其作为干细胞示踪手段的应用。而纳米荧光量子点具有高光学稳定性及可调变的发光区间，提高了荧光成像在体内长期追踪干细胞的能力。当前可通过调节量子点的组分及缺陷态结构使量子点实现近红外（Near Infrared，NIR）发射， 以增加成像的深度和信噪比。王强斌等人制备了具有近红外二区（NIR-Ⅱ，1000~1700nm）发光性能的Ag2S 量子点并结合经典的生物发光红色荧光素酶（RFLuc）标记人间充质干细胞（hMSC），实现了对移植的hMSC在颅骨缺损小鼠模型中的存活和成骨分化的动态跟踪。然而，量子点中所含重金属元素始终是干细胞示踪向临床应用转化的障碍。相比之下，近些年才被发现和发展起来的有机分子材料——聚集诱导发光（Aggregation-induced emission，AIE）材料，具有更好的生物安全性，及更高的荧光量子产率（~25%），而且也可被容易地设计和调整，以具备NIR 甚至NIR-Ⅱ发光的能力。Yang等人制备了近红外发射的AIE纳米点，量子产率高达33%，用于标记脂肪来源干细胞，示踪其修复皮肤损伤过程，表明AIE纳米点可稳定标记和示踪至少1个月时间。
1.2 磁共振及磁粒子成像纳米示踪剂
相比光学成像， 磁共振成像技术（MRI）具有更高的组织穿透深度和分辨率，同时又可获得解剖和生理信息。磁共振成像信号是在外界射频脉冲作用下水质子弛豫所导致的感生磁场变化信号。根据磁化矢量在外加磁场下向平衡态趋向时纵向（T1）及横向（T2）分量弛豫时间，将MRI分为T1/T1*或T2/T2*加权两类。以超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs）为基础的对比剂，通过缩短T2/T2*弛豫时间，产生较强的T2负性对比效应，为T2造影剂。与钆基MRI信号增强剂相比，SPIONs具有更好的生物相容性、更高的弛豫率、可降解性、磁控靶向性和更长的体内留存时间等特点，近年来被广泛用于标记干细胞。作为一种简单有效的外源性标记策略，在动物模型上，以SPIONs为造影剂的MRI成像已被用于胚胎干细胞、骨髓间充干细胞、神经干细胞等多种类型干细胞移植后的体内示踪。实际上，SPION因为较早被美国FDA批准应用于造影，其作为干细胞示踪剂已进入临床研究阶段。早在2006年，Zhu等就利用Feridex Ⅳ与Effectene复合物标记患者自体移植神经干细胞并示踪其在脑损伤区域的增殖与迁移。2010年，Jozwiak等在Cel l Medicine 发表了一项临床研究报告，他们用聚赖氨酸修饰的Ferumoxides复合物标记自体脐带血来源神经祖细胞，48h后移植到缺血性脑损伤的婴儿脑室，每个月连续注射3次细胞至侧脑室。分别于移植后1天、1周、1个月、2个月和4个月进行磁共振成像示踪，显示移植细胞可沿着侧脑室壁排列，随访到第6个月，神经损伤状况有所改善，证明了脑室内细胞移植的可行性和安全性。
磁粒子成像（Magnetic Particle Imaging，MPI）是一种全新的基于磁纳米颗粒示踪剂的成像方式。2001年，德国汉堡飞利浦实验室科学家Gleich提出MPI概念，并和Weizenecker在2005年研制首台MPI扫描仪。MPI通过直接探测调制场的非线性响应直观地反映示踪材料的分布，而机体组织具有反磁性，不产生MPI信号， 所以MPI对于目标信号的显像具有很高的信噪比。经磁粒子标记的细胞的MPI成像不仅具有高灵敏度、高对比度和几乎为零的信号衰减，还能准确地量化成像体积中细胞数量，因此MPI用于干细胞示踪成像具有很大优势。Bulte等在小鼠两侧大脑半球中注射MNP标记的不同数量的干细胞并行MPI扫描，发现MPI信号强度与注入的不同数量细胞之间存在相关性。Zheng等用铁氧化物标记MSC，采用纵向MPI-CT成像技术与等离子体质谱技术检测生物体内不同器官（肝脏、脾脏、心脏、肺部等）铁的含量，进而分析MSC的生物分布情况，结果表明两种方式最终测量结果非常一致（R2 =0.943）， 说明MPI拥有在无创成像、量化细胞疗法及其他治疗药物的系统分布方面强大的实用价值。
1.3 超声成像纳米示踪剂
超声成像具有安全、较大的组织穿透深度的优点，但软组织分辨率较差，用于细胞示踪时需要超声增强造影剂（UCAs）的参与。传统的UCAs是由脂质、蛋白质或生物相容性聚合物包裹的微气泡，有气态的内核和柔软的外壳，当进入血液或组织时有较高的可压缩性, 当超声作用到这些微泡时，在声压作用下可引起体积变化, 产生强反射回波。然而，这些微泡的微米尺度、较差的结构稳定性以及较短的半衰期限制了其在干细胞示踪中的应用。所以最近许多工作集中在UCAs的小型化上，纳米UCAs，如纳米气泡、二氧化硅纳米颗粒和纳米管，已经被开发用于移植干细胞的超声成像示踪。其中，玻璃基纳米材料及氧化硅纳米粒子等，由于具有刚性特征，跟组织的界面上存在高阻抗失配，可以显著增强超声信号。Foroutan等合成了可生物降解的P2O5-
CaO-Na2O 磷酸酯基玻璃纳米球（PGNs），作为超声造影剂标记MSC，发现其在体内和体外的检测限分别为5μg/mL和9μg/mL，可用于4000 个细胞超声成像，且PGNs可生物降解，其降解产物容易在体内代谢。这些刚性纳米粒子由于其相对较高的结构稳定性、低毒性和可调节的结构和尺寸，在超声成像实时干细胞跟踪中具有较好的应用前景。
1.4 光声成像纳米示踪剂
光声成像（PAI）基于光声效应。在成像过程中，近红外（NIR）激光源将光以脉冲（1~100ns）的形式打到目标组织上，引起目标组织经历热弹性膨胀，释放机械波，被PAI检测器作为信号检出。这种成像方式将光学成像的高对比度与超声成像的深穿透性相结合，能以实时和非侵入性的方式提供功能和解剖信息，但对细胞成像来说其空间分辨率不够，需要结合光声成像对比剂。光声成像对比剂可以是内源性的强吸收分子（ 如脱氧血红蛋白、黑色素、脂质等）或外源性的小分子染料，如FDA批准的ICG和其他近红外菁染料。但这些分子差的水溶性及光稳定性影响了它们的活体细胞示踪应用。具有近红外吸收性能的纳米材料则有好的光学稳定性和水分散性，因此很多被开发用作移植干细胞位置追踪、功能表征、活性监测的PAI探针。目前常用的纳米造影剂主要有金纳米颗粒、普鲁士蓝纳米颗粒、黑色素纳米颗粒及其他有机纳米粒子等。其中，金纳米颗粒因其优异的光热转换效率、稳定的成像能力和生物安全性而被广泛应用于移植干细胞成像中。Suggs等采用不同大小（20nm、40nm、60nm）的金纳米球标记并追踪体内MSC，并证明了纳米颗粒标记后细胞功能仍能维持。此外，被标记的干细胞可在14天内被检测到，表明PAI可长期、无创地跟踪细胞。
2 新兴功能纳米材料与干细胞治疗
2.1 抗氧化纳米材料提高移植干细胞成活率
组织损伤处通常伴有较高的活性氧浓度及炎性浸润，对移植干细胞的存活非常不利，所以采取抗炎及抗氧化干预对提高干细胞植入率非常有必要。基于纳米制备技术得到的缺陷态掺杂氧化铈（CeO2-x）具有抗氧化性能，最近十多年被广泛应用于抗炎抗氧化，保护及调节干细胞功能。Traversa等人制备了5～8nm CeO2-x纳米粒子，与心脏前体细胞共培养，细胞电镜发现内吞的纳米粒子在细胞胞质中可存留7天， 并持续发挥抗氧化作用帮助心脏前体细胞对抗氧化应激，从而保持细胞的分化功能。CeO2-x 持续的抗氧化功能来自其纳米制备工艺形成的氧空位，即Ce3+，且基于Ce3+的电化学性质，当其被有害的活性氧消耗之后，能很容易通过周围环境中还原性物质再生，这也是以CeO2-x 为代表的大部分纳米酶材料发挥其长效抗氧化功能的基本原理。2017年，Li等人通过等离子喷涂技术制备了两种掺杂CeO2的羟基磷灰石涂层HA-10Ce和HA-30Ce，研究了CeO2 的添加对骨髓间充质干细胞（BMSC）反应的影响。结果表明HA涂层中CeO2含量的增加使BMSC在细胞增殖、碱性磷酸酶活性和矿化结节形成方面具有更好的成骨行为。
2.2 磁性纳米材料结合磁场调控干细胞的增殖与分化
由于细胞表面带有电荷，且有各种离子通道及带电离子的进出，胞质及细胞器内也有一定量的自由基，即含有自旋不饱和电子对的基团存在，所以细胞被认为有一定抗磁性，同理细胞外的基质蛋白也有一定抗磁性，所以磁场理论上可以调节细胞的多种功能，包括细胞形态、细胞增殖情况、细胞周期分布、细胞凋亡以及细胞分化、细胞基因表达等。但考虑到安全性，应用于生物调节的磁场一般较弱，且不能聚焦作用于细胞。磁性纳米材料对磁场有强的响应性能，可以吸收磁场能量后聚焦和放大磁场作用。所以用来标记细胞后对细胞进行磁场调控。当然，磁性纳米粒子本身也对干细胞的分化行为有一定影响。2016年Wang等人通过基因微阵列分析和生物信息学分析，探究了超顺磁氧化铁纳米颗粒促进MSC成骨分化的分子机制。结果表明，超顺磁性氧化铁纳米激活了经典的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，通过调节该通路下游基因最终增强了干细胞向成骨的分化。在骨再生医学中，有研究证实，当磁性纳米粒子标记的干细胞与磁场联合使用后，对于骨折愈合、骨关节炎的治疗等具有明显的促进作用。其次，磁纳米粒子标记的干细胞可以在磁场诱导下在损伤部位聚集定植，从而减少干细胞流失，并利于细胞成团生长。Sasaki等人报道磁纳米粒子标记的干细胞经静脉注射后，在磁场作用下，可在兔脊柱损伤部位富集，干细胞在损伤部位的富集密度显著高于非标记干细胞。其次，磁纳米粒子标记的干细胞还可以在磁场诱导下进行图案化排布形成特定形状的无支架细胞膜片，细胞膜片的形成可以增强细胞与细胞间连接和交流，促进分泌细胞外基质和细胞的继续增殖，有利于后续的在体移植和组织再生应用。
3 总结与展望
当前，干细胞治疗走向临床转化的过程中还存在诸多问题，如安全性问题、治疗机制问题及植入率低等问题，而纳米功能材料在解决这些问题方面正发挥着其独特优势：（1）在成像示踪方面，纳米探针的优势在于它属于外源性标记物，标记方法简单且相对安全；此外纳米探针性能相对稳定、信噪比高（比如AIE纳米点的高对比度和长时间示踪性能），如果对应的成像手段也有一定优势（如磁粒子成像的安全性、高穿透性、高对比度和可定量性），可以期待不久的将来，一些新的纳米示踪剂会与干细胞治疗一起走向临床转化应用。此外，纳米材料的更大优势在于它可以进行功能集成，所以基于纳米材料的新型多模态示踪探针、诊疗一体化探针以及能反映干细胞功能的探针研发也是未来继续发展的方向。（2）抗氧化纳米材料因为其独特的化学性能，可以在干细胞移植微环境中发挥长效的抗氧化、抗炎性能，利于提高干细胞存活和植入率。（3）磁性纳米粒子，这类兼具示踪性能、载体性能、治疗性能及外场远程可控性能的纳米材料与干细胞治疗相结合具有巨大的应用潜力。最近，基于磁场调控标记或者无标记干细胞进行非支架组装的研究非常值得关注。
（ID ：yxckbsc2021040101）
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